¿Cómo hacer cultivo líquido? La guía definitiva

Suministros/Materiales

• 600 ml de agua destilada o filtrada
• 12 ml de jarabe de maíz
• 1g de extracto de malta claro
• 1g de peptona (Opcional)

Herramientas

• Frascos Mason modificados (1 L/1 qt.)
• Jeringa de esporas Golden Teacher
• Olla a presión / Olla de cocción
• Báscula
• Papel de aluminio
• Alcohol isopropílico al 70%
• Canica / Piedra (para romper el micelio)

Instrucciones

1. 1.

   Añade jarabe de maíz, LME y peptona al agua

   
   Primero, asegúrate de que tus frascos Mason sean adecuados. Esta receta está hecha para un frasco Mason, idealmente con una capacidad de 1L. Si aún buscas una buena opción, te recomendamos los frascos Mason que nosotros mismos usamos, los cuales puedes encontrar aquí.

   
   

   Debe ser resistente al calor hasta 121 °C (250 °F) y necesita una tapa modificada con un puerto de inyección, donde puedas inyectar las esporas más tarde sin abrir el frasco, evitando riesgos innecesarios de contaminación. También necesitarás un medio para el intercambio de aire, por lo que necesitas un segundo orificio cubierto con cinta de microporos o un disco de filtro. Un orificio simple cubierto con cinta de microporos es la opción más sencilla.

   
   

   Luego, llena el frasco con agua destilada o filtrada. También podrías usar agua del grifo o embotellada, pero pueden contener químicos o minerales que podrían afectar el crecimiento del micelio. Ahora agrega el jarabe de maíz, el extracto de malta claro y, si lo tienes a mano, la peptona.

   
   

   ¿Por qué jarabe de maíz? No afecta la visibilidad a diferencia de la miel, proporciona nutrientes de fácil acceso para el micelio, es resistente al calor y no se cristaliza tan rápidamente como otros azúcares.

   
   

   ¿Por qué peptona? No es necesaria, pero proporciona nutrientes adicionales para un crecimiento más rápido y fuerte del micelio.
2. 2.

   Mezclar hasta que se disuelva por completo

   
   Mezcla a fondo hasta que todo se disuelva por completo. Asegúrate de que el jarabe de maíz no se pegue al fondo o a los lados del frasco. Revuelve hasta que la solución esté clara y ya no veas grumos ni residuos.

   
   

   Si el jarabe de maíz es difícil de disolver, intenta usar agua ligeramente tibia, ya que esto ayuda a que se descomponga más fácilmente. No te preocupes si el líquido se ve un poco turbio en esta etapa, esto es completamente normal.
3. 3.

   Preparación para la esterilización

   
   Ahora, añade tu canica. También puedes usar una piedra pequeña, aunque los profesionales suelen usar un agitador magnético, ya que rompe el micelio de manera más efectiva. Es necesario romper el micelio más adelante en el proceso para un crecimiento más rápido. Luego, coge tu tapa y cierra el frasco.

   
   

   Ahora, envuelve un poco de papel de aluminio alrededor de la tapa para que quede completamente cubierta. Esto es importante porque protege el puerto de inyección y el disco de filtro de intercambio de aire durante la esterilización.
4. 4.

   Esterilizar la mezcla

   
   Ahora usa tu olla a presión a 15 PSI durante 30 minutos o 12 PSI durante 45 minutos para esterilizar la mezcla. Recomiendo esterilizar varios frascos a la vez, por si acaso uno se contamina.

   
   

   Si no tienes una olla a presión, también puedes intentar un baño de vapor. No lo he probado para una solución de cultivo líquido, pero para agar funciona bastante bien en aproximadamente 1 hora. Ten en cuenta, sin embargo, que un baño de vapor puede no alcanzar las mismas temperaturas que una olla a presión, por lo que la esterilización puede ser menos fiable.

   
   

   Obtén más información sobre la esterilización y pasteurización.
5. 5.

   Deja enfriar

   
   Después de esterilizar, deja enfriar toda la olla a presión durante unas horas hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto es importante porque inyectar las esporas en un frasco todavía caliente podría matarlas, arruinando todo el lote.

   
   

   Después, la solución tendrá un color amarillo dorado, debido al jarabe de maíz y al LME. También puedes ver pequeñas partículas flotando en la solución. Estas son solo residuos de nutrientes, que serán consumidos por el micelio con el tiempo.
6. 6.

   Inoculación

   
   Una vez que tus frascos se hayan enfriado, puedes preparar todo para la inoculación. Asegúrate de trabajar en un ambiente estéril, como una caja de aire quieto o frente a una campana de flujo laminar, y usa guantes, mascarilla y alcohol isopropílico al 70% para desinfectar todo.

   
   

   Ahora puedes comenzar a quitar el papel de aluminio. Asegúrate de que el frasco aún esté completamente cerrado y que todo, incluido el puerto de inyección y la cinta microporosa, siga en su lugar.
   

   
   

   Toma tu jeringa de esporas y agítala para distribuir las esporas uniformemente. Si estás reutilizando una aguja, esterilízala brevemente con llama y déjala enfriar antes de continuar. Luego, enrosca la aguja, limpia el puerto de inyección con alcohol isopropílico y déjalo secar durante unos segundos antes de insertar la aguja. Dispensa de 2 a 4 ml de la solución de esporas por frasco. Esto debería ser suficiente.

   
   

   También puedes usar otra jeringa de cultivo líquido u otra forma de micelio como agar colonizado, pero esto es un poco más propenso a la contaminación porque tienes que abrir la tapa.
   💡

   Antes de usar la jeringa de esporas, recomiendo probarla en agar para ver si está limpia, ya que las esporas pueden estar contaminadas.
7. 7.

   Colonización y Almacenamiento

   
   Guarda tus frascos entre 21 y 28 °C (70 a 82 °F) en un lugar oscuro y asegúrate de evitar por completo la luz solar directa. Cualquier temperatura inferior a 21 °C (70 °F) causará un crecimiento más lento, mientras que cualquier temperatura superior a 28 °C (82 °F) fomentará el crecimiento bacteriano si está presente. Ese rango es el ideal para la mayoría de las cepas de P. cubensis.

   
   

   Después de 7 días, deberías poder ver los primeros signos de crecimiento, que aparecerán como pequeñas nubes blancas formándose en la solución. A partir de este momento, agita el frasco regularmente y usa tu canica para romper el micelio. Recomiendo hacer esto una vez por semana. Con el tiempo, la nube de micelio comenzará a crecer lentamente.

   
   

   Después de aproximadamente 3 a 4 semanas, dependiendo de la cepa y otros factores como la genética o la temperatura, el cultivo líquido debería estar listo para ser usado para hacer jeringas de cultivo líquido.
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   Llenar las jeringas de cultivo líquido

   
   Una vez que tu cultivo líquido esté completamente colonizado, puedes comenzar a llenar tus jeringas de cultivo líquido. Este paso es importante para que puedas usar tu LC correctamente. Antes de comenzar, rompe el micelio una vez más para distribuirlo uniformemente por todo el frasco, luego déjalo reposar por un minuto para que quede uniformemente suspendido en la solución.

   
   

   Asegúrate de trabajar nuevamente en un ambiente estéril. Desinfecta el puerto de inyección con alcohol isopropílico al 70% y déjalo secar por unos segundos, luego enrosca la aguja en la jeringa. Ambas deben estar idealmente preesterilizadas. Si estás reutilizando la aguja, esterilízala con llama durante 10 a 15 segundos y déjala enfriar antes de usarla. Luego inserta la aguja en el puerto de inyección y tira lentamente del émbolo hasta que la jeringa esté llena.

Conclusión